Nrf2-GPX4信號通路與冠心病患者相關性研究
摘 要：目的：通過檢測血清Nrf2、GPX4活性水平，分析其與冠心?。╟oronary heart disease，CHD）以及冠脈病變嚴重程度的相關性，探討其信號通路介導的鐵死亡途徑在CHD病情進展中的作用。方法：選取540例疑診CHD患者，行冠狀動脈造影檢查，其中360例病人明確診斷為CHD，冠狀動脈造影無異常180例為對照組（CON組）。通過ELISA檢測CHD患者血清中Nrf2和GPX4活性水平，統計分析在有無CHD血清中Nrf2和GPX4活性差異，Western blot 檢測CON組和CHD組（各90例）外周血單核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCS）Nrf2蛋白的表達，分析其信號通路在CHD患者中的表達意義。結果：CHD組中Nrf2、GPX4活性水平均較對照組降低（P<0.05），且Westernblot檢測兩組患者PBMCs中Nrf2的表達水平：CHD組Nrf2（0.25±0.05）蛋白表達水平較CON組（0.87±0.16）是呈下調趨勢（P<0.05），表明Nrf2蛋白表達水平在CHD患者是低表達的。Pearson相關性分析顯示：血清Nrf2、GPX4水平與Gensini評分負相關（Nrf2：r=-0.347，P<0.001；GPX4：r=-0.423，P=0.001）。Nrf2、GPX4與TG負相關（Nrf2：r=-0.284，P<0.001；GPX4：r=-0.275，P=0.001），Nrf2和GPX4水平與 LDL 呈負相關（Nrf2：r=-0.418，P<0.05；GPX4：r=-0.426，P<0.05），Nrf2和GPX4水平與HDL呈正相關（Nrf2：r=0.318，P<0.05；GPX4：r=0.428，P<0.05），Nrf2與GPX4呈正相關（r=0.456，P<0.01）。結論：Nrf2-GPX4信號通路介導的鐵死亡途徑與冠脈病變程度及CHD的發病機制有著密切關系，且其作用機制可能與Nrf2-GPX4信號通路表達下調有關。
關鍵詞:冠狀動脈疾病;病變狹窄程度; Nrf2; GPX4;
Correlation between Nrf2-GPX4 signaling pathway and patients with coronary
heart disease
XING Bu-dian LI Hui QIANG Tian-tian WEI Ting LU Yuan-yuan KANG Pin-fang
ZHANG Ning-ru
Department of Cardiology, First ffliated Hospital of Bengbu Medical College
Basic
and Clinical Key Laboratory of Cardiovascular and Cerebrovascular Diseases, First
filiated Hospital of Bengbu Medical College Department of Ophthalmology, First
Affliated Hospital of Bengbu Medical College Bengbu Third People's Hospital Afliated
to Bengbu Medical College
Abstract：Objective: To analyze the correlation between serum Nrf2 and GPX4 activity levels with coronary heart disease (CHD) and the severity of coronary artery disease, and to explore the role of ferroptosis mediated by its signaling pathway in the progression of CHD. Methods: A total of 540 patients suspected of CHD were selected for coronary angiography, of which 360 patients were diagnosed with CHD. The activity levels of Nrf2 and GPX4 in the serum of CHD patients were detected by ELISA, and the differences in the activities of Nrf2 and GPX4 in the presence or absence of CHD were statistically analyzed. Western blot detection of Nrf2 protein expression of peripheral blood mononuclear cells (PBMCS) in CON and CHD groups (90 cases each).The expression and significance of its signaling pathway in CHD patients were analyzed. Results: The activity levels of Nrf2 and GPX4 in the CHD group were lower than those in the control group (P<0.05), and the expression levels of Nrf2 in PBMCs of the two groups were detected by Western blot: The protein expression level of Nrf2 in CHD group (0.25±0.05) was down-regulated compared with CON group (0.87±0.16)(P<0.05),indicating that Nrf2 protein expression level is low in CHD patients. Pearson correlation analysis showed that serum Nrf2 and GPX4 levels were negatively correlated with Gensini score (Nrf2: r=-0.347, P<0.001; GPX4: r=-0.423, P=0.001). Nrf2 and GPX4 were negatively correlated with TG (Nrf2: r=-0.284, P<0.001; GPX4: r=-0.275, P=0.001), and Nrf2 and GPX4 levels were negatively correlated with LDL (Nrf2: r=-0.418, P<0.001) 0.05; GPX4: r=-0.426, P<0.05), Nrf2 and GPX4 levels were positively correlated with HDL (Nrf2: r=0.318, P<0.05; GPX4: r=0.428, P<0.05), Nrf2 was positively correlated with GPX4 ( r=0.456, P<0.01). Conclusion: The ferroptosis pathway mediated by the Nrf2-GPX4 signaling pathway is closely related to the degree of coronary artery disease and the pathogenesis of CHD, and its mechanism may be related to the down-regulation of the Nrf2-GPX4 signaling pathway.
Keyword：Coronary artery disease; Degree of stenosis; Nrf2; GPX4;
冠心?。╟oronary heart disease,CHD）是主要是由于冠狀動脈狹窄或者供血不足，繼而引發心肌供氧和血供應不足、心肌血管耗氧急劇增加，最終導致心肌壞死[1,2,3]。流行病學調查結果表明，CHD嚴重危害人類生命健康，并呈現年輕化、發病率逐年上升的趨勢[4]。
谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase4，GPX4）是一種重要的抗氧化酶，能夠將脂質ROS還原為無毒的脂質醇，減少脂質過氧化，有效預防了細胞的氧化應激，從而抑制了鐵死亡進程[5]。近期研究[6]發現，GPX4介導的鐵死亡與CHD有著密切的聯系。Nrf2抗氧化劑是細胞氧化應激和鐵死亡重要的信號通路[7,8]。近年來相關研究[9,10]發現，激活Nrf2可通過促進GPX4的表達進而抑制鐵死亡。而目前Nrf2-GPX4信號通路介導的鐵死亡在CHD 中的發病機制尚不明確。本研究擬通過檢測Nrf2及GPX4水平，分析其與冠狀動脈狹窄程度不同CHD病人的關系，為CHD診斷治療提供新依據。
1 資料與方法
1.1材料試劑
Nrf2抗體（貨號：12721S；產地：美國CST）、GAPDH抗體（貨號：5174；產地：美國CST）；ELISA檢測試劑盒：HumanNrf2（上海羽朵）、HumanGPX4（上海羽朵）
1.2 研究對象
收集2020年6月至2022年6月我院540例疑診CHD患者，平均年齡（64.52±9.66）歲，根據CHD診斷指南[11]，以任意一支主要冠脈狹窄≥50%即可診斷為CHD。其中，360例明確診斷為CHD，冠狀動脈造影無異常180例患者納入CON組。入選患者均簽署知情同意書。所有入選患者均排除既往有心肌炎、心肌病、惡性腫瘤類疾病、風濕免疫系統疾病、內分泌及代謝性疾病及感染性疾病[12]。入選患者均簽署知情同意書，研究方案獲得本院倫理委員會批準( 2019KY023)。
1.3方法
1.3.1標本采集
所有患者入院后空腹過夜后，抽取外周靜脈血10 mL，置于肝素抗凝管中，3000 r/min離心10 min后吸取上清，并于-80 ℃下冷凍保存備用。
1.3.2 ELISA檢測患者血清中Nrf2、GPX4水平
采用 HumanNrf2、GPX4（上海羽朵）檢測受試者血清中Nrf2、GPX4的表達水平，嚴格按說明書進行操作。
1.3.3 Western blot檢測Nrf2-GPX4信號通路在CHD組和CON組中的Nrf2蛋白的表達
提取PBMCS中總蛋白,依據BCA蛋白定量法，測定各組蛋白濃度，配置10%SDS－PAGE電泳，PVDF膜轉膜，抗體稀釋比：抗Nrf2兔單克隆抗體1∶1 000、抗GAPDH兔單克隆抗體1∶10 000；一抗二抗孵育；洗膜后ECL發光液曝光，成像系統獲取圖像[13]。
1.3.4統計學方法
組間比較采用t檢驗、卡方檢驗，應用Pearson分析法分析指標間的相關性，以上數據采用SPSS26.0軟件分析。
2. 結果
2.1受試者一般資料和生化指標分析
與CON組比較，CHD組年齡、吸煙史、高血壓病史、糖尿病史、TG、LDL均是升高的；而HDL卻是降低的（P均<0.05）；而兩組間性別比、BMI、WBC、AST、ALT、TC、和Scr無明顯差異（P> 0.05），結果見表 1。
表1 CON組和CHD組的一般資料和生化指標比較（`x±s）
Tab 1 Comparison of general data and biochemical indexes between CON group and CHD group
注：WBC：白細胞計數；BMI：體重指數；ALT：谷丙轉氨酶；AST：谷草轉氨酶；TC：總膽固醇；TG：甘油三酯；HDL：高密度脂蛋白；LDL：低密度脂蛋白；Scr:血肌酐；
2.2 CON組和CHD組受試者Nrf2、GPX4以及Gensini評分
與CON組比較，CHD組血清Nrf2、GPX4活性水平均是降低的；而Gensini評分卻是明顯增大的（P均<0.05）結果見表2。
表2 CON組和CHD組受試者Nrf2、GPX4以及Gensini評分比較
Tab 2 Comparison of Nrf2, GPX4 and Gensini scores between CON group and CHD group
2.3 CON組和CHD組受試者（各90例）PBMCS中Nrf2蛋白表達水平
CHD組Nrf2（0.25±0.05）蛋白表達水平較CON組（0.87±0.16）是呈下調趨勢的（P<0.05）,見圖A,圖B。
圖A CON組和CHD組患者PBMCs中蛋白條帶
圖B 兩組患者PBMCs中蛋白表達量相對大小
2.4 Nrf2、GPX4與Gensini 評分以及血液指標的相關性
經Pearson相關性分析：血清Nrf2、GPX4水平與Gensini評分負相關（Nrf2：r=-0.347，P<0.001；GPX4：r=-0.423，P=0.001）；Nrf2、GPX4與TG負相關（Nrf2：r=-0.284，P<0.001；GPX4：r=-0.275，P=0.001）；Nrf2和GPX4水平與 LDL 呈負相關（Nrf2：r=-0.418，P<0.05；GPX4：r=-0.426，P<0.05）；Nrf2和GPX4水平與HDL呈正相關（Nrf2：r=0.318，P<0.05；GPX4：r=0.428，P<0.05）；Nrf2與GPX4呈正相關（r=0.456，P<0.01），結果見表3。
表3 血清Nrf2及GPX4活性水平與 Gensini評分以及血液指標的相關性分析
Tab 3 Correlation analysis of serum Nrf2 and GPX4 activity levels with Gensini scores and blood indexes
3 討論：
CHD是臨床上最常見、最主要的疾病，主要由冠脈粥樣硬化介導的管腔狹窄或堵塞所導致，且隨著冠脈病變的加重，從而更容易造成冠狀動脈的狹窄或者供血不足，最終引起心肌功能障礙[14,15]。迄今為止，CHD發病機制尚未明確。CHD高致殘率與致死率的特點，給患者的生命安全與生活質量造成影響。因而，深入地研究CHD發生機理，有助于CHD的診療及早期預防。
研究表明，血脂異常為CHD發生的一種重要危險因素[16]。已有相關研究[17,18]指出，高TG血癥、高LDL血癥、低HDL血癥與CHD的發生、發展密切相關，且通過改善患者血脂水平，有利于緩解CHD癥狀，促進病情轉歸。在本次研究中，CHD組TG、LDL明顯高于CON組，而HDL水平卻是降低的，考慮機制可能與血脂異常致動脈粥樣硬化有關。
鐵死亡是非凋亡的細胞死亡的一種形式，依賴于鐵元素的脂質活性氧( ROS) 的積累。脂質ROS在細胞內的不斷堆積，引發細胞內的氧化應激反應，逐步誘發細胞的鐵死亡[19]。近年來多項研究表明[20,21]，鐵死亡與CHD密切相關。
GPX4是一種選擇性中和脂質氫過氧化物的硒酶，被認為是鐵死亡的重要內源性調節劑。有研究表明[22]，抑制GPX4的活性，其催化的還原反應不能代謝過氧化脂質，脂質過氧化產生的Fe2+和ROS的不斷積累最終導致鐵死亡。鑒于GPX4在鐵死亡進程中的起著重要作用，其成為鐵死亡調控因子的研究熱門。Meng等[23]在糖尿病動脈粥樣化小鼠模型中觀察到，GPX4活性降低引起脂質過氧化，繼而引起鐵死亡，促進了動脈粥樣硬化的發展，而鐵死亡抑制劑通過增加GPX4活性，減少脂質活性氧的生成，進而減緩了動脈粥樣硬化的發展，該現象表明GPX4活性可能與可能與心肌缺血性疾病CHD有潛在聯系。FENG等[24]研究發現，鐵死亡抑制劑通過增加GPX4活性，減少了脂質活性氧的生成，繼而保護大鼠心臟減輕缺血性損傷。此外，Li等[25]通過實驗發現，恢復GPX4活性水平，能夠抑制鐵死亡，繼而可保護小鼠心肌免受缺血再灌注損傷。近期臨床實驗研究[6]發現，ACS患者GPX4活性水平明顯低于非ACS病人。這與本此研究結果相類似，本研究發現相較于CON組，CHD患者GPX4活性水平是降低的，提示GPX4可能參與了CHD的發生、發展。
Nrf2作為鐵死亡主要調節因子，其不僅是氧化應激反應和鐵死亡的參與者，同時也是氧化應激反應和鐵死亡過程的調控者。Nrf2調控著與鐵死亡相關的酶和蛋白質如GPX4[9]。Yu等[26]通過研究發現，抑制Nrf2可通過下調GPX4表達，增加了鐵死亡，進而促進了小鼠動脈粥樣硬化的形成，而鐵死亡抑制劑可通過激活Nrf2，增加GPX4表達，使鐵死亡進程受抑制，繼而抑制了小鼠動脈粥樣硬化的形成，該現象表明Nrf2-GPX4信號通路介導的鐵死亡可能與CHD有潛在的聯系。據報道，柚皮素可以通過調節大鼠體內Nrf2-GPX4信號通路，抑制鐵死亡，減輕心肌缺血性損傷[27]。陳玉等[10]通過實驗觀察到，激活Nrf2-GPX4信號通路，能夠抑制鐵死亡，減輕了大鼠心肌缺血性損傷。本研究結果顯示，較CON組相比，CHD組患者血清Nrf2活性水平是明顯降低的，此外，本研究完善了PBMCS中Nrf2蛋白濃度的測定，WB蛋白濃度變化趨勢與ELISA結果一致，繆瑩[28]也報道了類似結果。Pearson 相關分析顯示，CHD患者血清Nrf2與GPX4呈正相關關系，而其作用機制可能通過氧化應激和鐵死亡相互聯系，從而可能參與了CHD的發生、發展。
Gensini評分是評估冠脈狹窄嚴重程度的有效方法，分值越高，提示冠脈狹窄越嚴重[29]。本次研究發現，Nrf2和GPX4與Gensini評分均呈負相關，這一結果提示Nrf2-GPX4信號通路介導的鐵死亡與CHD病變程度有關，對于評價CHD患者嚴重性具有一定的積極意義。
綜上所述，與CON組比較，CHD組血清Nrf2與GPX4活性水平是降低的，Nrf2與TG、LDL、以及GPX4水平之間呈正相關，Nrf2和GPX4分別與HDL呈負相關，且Nrf2和GPX4與Gensini評分均呈負相關。因此，Nrf2-GPX4信號通路介導的鐵死亡對于判斷冠脈病變程度及CHD的發病機制具有一定的參考價值。本研究存在以下不足：納入樣本量少、數據誤差不可避免，因此，本文結果還需大規模多中心研究進一步驗證。
作者貢獻度說明：
邢布點：數據分析、文章撰寫工作；強甜甜、魏婷、盧園園：收集數據，負責相關實驗操作；李輝、康品方、張寧汝：設計實驗，指導寫作。本研究作者聲明任何與本文有關的利益沖突均不存在。
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