褪黑素治療創傷性腦損傷的研究進展

　　摘    要：創傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）是由外力引起的大腦結構和生理功能破壞的損傷性疾病，包括原發性和繼發性腦損傷。原發性腦損傷現階段無法通過臨床治療手段來干預其發生、發展和預后；現有證據表明，繼發性腦損傷致病機制包括氧化應激、炎癥反應、神經興奮性毒性、鈣離子超載、細胞凋亡、線粒體自噬等一系列應激調控反應。褪黑素具有抗炎、抗氧化、抗凋亡以及提高自噬水平的治療作用，具有透過血腦屏障和細胞膜的能力。本文重點討論褪黑素在TBI中的保護作用機制，為TBI的臨床治療尋找新的研究方向。

　　關鍵詞:創傷性腦損傷;褪黑素;氧化應激;炎癥反應;細胞凋亡;線粒體自噬;神經元再生;

　　創傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）是重要的公共衛生問題，具有高發病率、高致殘率和高死亡率的特點。其發生是由于大腦突然受到打擊或震動、破壞了腦正常功能而引起。TBI最常見的病因包括接觸性運動、車禍、家庭暴力或戰爭傷害[1]，總體預后較差，死亡率在10%~70%之間，長期發病率顯著[2]，給社會造成了重大負擔。雖然神經外科和重癥監護治療有所改善，但嚴重TBI患者的死亡率仍然很高，目前缺乏對TBI有效的綜合治療策略和治療藥物。

　　褪黑素主要是由哺乳動物和人類松果體產生的一種胺類激素，前體是色氨酸，其合成受晝夜周期及交感神經的影響。在血漿及腦脊液中褪黑素水平呈現晝夜節律性，在夜間分泌水平較高，具有促進睡眠、調節時差、抗衰老、調節免疫、調節內分泌節律、抑制腫瘤生長等多項生理功能，并且褪黑素具有強大的抗氧化活性以及其在各種組織再生中發揮作用，包括神經系統、肝臟、骨骼、腎臟、膀胱、皮膚和肌肉等[3]。褪黑素的代謝主要在肝臟和腦進行，代謝產物主要由腎臟排出，人體補充外源性褪黑素后幾小時即降至正常生理水平，不會造成褪黑素及其代謝產物的蓄積。

　　褪黑素的生理作用是由三種膜受體（MT1、MT2和MT3）介導的[4]。MT1和MT2主要分布在嚙齒動物的大腦區域神經系統，包括視交叉上核、小腦、丘腦、海馬體和周圍組織[5]。褪黑素在臨床上主要用于調節晝夜節律和誘導睡眠，目前研究發現褪黑素有強大的抗氧化、抑制炎癥以及可以透過血腦屏障和細胞膜等生理作用，并且褪黑素的親脂性使它能夠很容易穿過細胞膜并到達亞細胞隔室[6]，使TBI廣泛的反應過程中斷，如代謝級聯反應、不加區分的神經遞質釋放、氧化應激和線粒體功能障礙等，Campolo等[7]和Kelso等[8]采用褪黑素和地塞米松、二甲胺四環素聯合治療TBI，目前在TBI動物模型中取得療效。Rui等[9]最新研究發現褪黑素通過抑制鐵蛋白重鏈介導的鐵下垂來治療TBI，可以改善TBI后認知功能[10]。褪黑素可能在多個發生發展階段對TBI產生治療作用。

　　1 褪黑素在TBI中抑制氧化應激作用

　　活性氧誘導的氧化應激反應可能參與了繼發性腦損傷的病理生理過程，并且加劇原發性腦損傷，TBI后通過巨噬細胞吞噬損傷相關分子模式（damage-associated molecular patterns molecules，DAMPs）導致溶酶體損傷，釋放溶酶體化合物，致使活性氧水平升高[11]。褪黑素及其代謝產物是一種廣譜抗氧化劑和非常有效的自由基清除劑，它可與自由基直接反應發揮作用[12]，也可以通過相應的通道蛋白減少活性氧的生成與激活，可能與瞬時受體電位(melastatin- like transient receptor potential 2，TRP) M2通路和核轉錄相關因子（NF-E2-related factor 2，Nrf2）通路相關。

　　1.1 TRPM2通路

　　TRPM2是一種鈣離子滲透性非選擇性通道[13]，功能性的TRPM2通道主要集中在海馬、皮層和紋狀體等神經元密布的部位，這些部位容易受到TBI引起的氧化應激損傷[14]。褪黑素對活性氧的抑制作用主要通過調節TRPM2通道來減少鈣離子內流。Yürüker等[12]研究表明，創傷性腦損傷后細胞內Ca2+和活性氧水平升高，主要是由退化海馬神經元產生，給予褪黑素治療后通過抑制TRPM2通道激活減少Ca2+內流，使TBI大鼠海馬神經元細胞內活性氧的產生減少，抑制TBI后氧化應激反應。研究結果顯示應用褪黑素治療后對TRPM2通道呈現負性調節作用，通過TRPM2通道抑制氧化應激、細胞凋亡和Ca2+內流，從而產生神經保護作用。TRPM2通道之前已經被發現與其他神經退行性疾病有關，此通道的激活是TBI的一個潛在的重要機制，褪黑激素可以通過TRPM2通路在氧化應激中恢復促氧化系統和抗氧化系統之間的平衡，對TBI產生保護作用。

　　1.2 Nrf2通路

　　核轉錄相關因子Nrf2可誘導內源性抗氧化酶的產生，Nrf2通路是一種多臟器保護途徑，在多種腦疾病中具有神經保護作用，包括TBI [15]。在氧化應激或損傷的條件下，Nrf2從Keap1-Nrf2復合物中釋放并轉移到細胞核中，在細胞核激活Nrf2通路[16]，進一步激活氧化應激反應。在Wang等[17]的研究中，使用Ramelteon（褪黑素受體激動劑）在TBI小鼠中增加核轉錄相關因子Nrf2的積累量，增加下游蛋白的表達，包括超氧化物歧化酶（superoxide dismutase-1，SOD-1），從而降低氧化應激水平。因此，在TBI中使用Ramelteon治療可以通過增強Nrf2的表達來抑制氧化應激反應，從而產生腦保護作用。

　　Dehghan等[18]研究發現褪黑素可顯著降低腦水腫、血腦屏障通透性和TBI后72 h的顱內壓，這些效應可能是由于抑制氧化應激所致，但機制尚不明確。在已有的研究證據中，發現褪黑素調節TBI中的氧化應激反應是多環節、多機制的病理生理過程。氧化應激在TBI中處于中心環節，理論上阻斷氧化應激過程的任何環節都能在TBI中發揮治療作用，抑制氧化應激反應對治療TBI是有效的[19]。褪黑素作為自由基清除劑，可直接清除創傷腦損傷中的活性氧，從中心環節直接抑制氧化應激反應，從源頭阻斷氧化應激反應，達到TBI的治療和保護作用。

　　2 褪黑素在TBI中的抗炎作用

　　Bao等[20]研究發現抑制細胞死亡是神經保護和預防相關炎癥反應的關鍵。當TBI發生時，腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）激活受體相互作用蛋白1（receptor- interactions protein 1，RIP1）被招募形成一種稱為壞死體的復合物，壞死體的形成是細胞壞死和促進炎癥的必要條件[21]。TNF介導的炎癥反應是通過腫瘤壞死因子受體相關因子（TNF receptor-associated factor，TRAF）調節[21]。TRAF是一種信號適配器蛋白，可將上游的受體與下游的適配器蛋白和效應酶連接起來，這是由C端TRAF結構域介導的。同時TRAF受體信號可誘導激活經典和非經典核因子κB信號通路以及激活腺苷酸激活蛋白激酶（5’AMP-activated protein kinase，AMPK）信號通路。

　　2.1 NF-κB通路

　　在TBI后，血清中TNF和細胞膜上TNFR1的表達水平顯著上升，當TNF被TNFR1識別時，TRAF即被招集，形成包含細胞凋亡抑制蛋白（cellular inhibitor of apoptosis proteins，cIAP）和RIP1的信號復合物[22]。RIP1是由cIAP泛素化產生，腫瘤壞死因子α誘導蛋白3（tumor necrosis factor-alpha-induced protein 3，TNFAIP3）是一種可以通過泛素編輯來修飾底物多泛素化的替代分子，這是炎癥反應的主要機制[23]。Bao等[20]研究發現在TBI中TNFAIP3可以通過抑制核因子κB和炎癥因子如IL-6、IL-1β以及NLRP3炎性小體的表達，來抑制炎癥反應。研究結果表明，TNFAIP3是調節和控制TBI后的壞死和炎癥是必不可少的，TBI后缺乏TNFAIP3會導致侵襲性壞死，并減弱褪黑激素的抗壞死和抗炎作用。與Zhong等[23]相關研究結果一致，本課題組通過C57小鼠建立TBI模型，術后即刻開始腹腔注射褪黑素，觀察對照組和實驗組炎癥蛋白的表達水平，目前的研究結果顯示褪黑素在TBI模型中可以直接抑制核因子κB和磷酸化核因子κB（phosphory- lation nuclear factor kappa-B，p-NF-κB）的表達，從而抑制炎癥因子IL-1β和IL-8和NLRP3等的表達水平，抑制炎癥反應。Onizawa等[24]的研究將核因子κB和RIPK3泛素化聯系起來，提出了TNFAIP3可能預防炎癥性疾病的創新機制。

　　2.2 AMPK通路

　　AMPK是一種重要的細胞內能量傳感器，深入參與能量代謝。AMPK的激活抑制了腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）的消耗，對氧化應激和細胞炎癥提供保護作用[25]。AMPK磷酸化在顱腦疾病的不同模型中具有潛在的保護作用[26]。環磷腺苷效應元件（CAMP-response element-binding，CREB）蛋白是一種著名的促生存蛋白，由AMPK家族成員蛋白控制，已有研究表明CREB的磷酸化通過調節p-NF-κB進一步阻斷炎癥介質的轉錄來降低神經炎癥反應[27]。Rehman等[28]發現褪黑素治療TBI具有神經保護作用，減少神經炎癥和神經變性。研究顯示TBI小鼠大腦中的p-AMPK水平和p-CREB水平和p-NF-κB水平升高，而給予褪黑激素治療后可顯著降低TBI小鼠大腦中的p-AMPK、p-CREB和p-NF-κB的表達水平。這些研究顯示TBI誘導腦能量供需不平衡，降低神經細胞的生存率，而褪黑素治療可通過調節p-AMPK/ p- CREB信號通路來克服能量消耗，減少神經炎癥反應，降低TBI后的神經損傷和神經變性。在Ding等[29]研究中發現哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合物（mechanistic target of rapamycin complex，mTOR）途徑可能參與褪黑素抑制TBI的炎癥反應，研究發現褪黑素可明顯抑制小膠質細胞激活、減少原始炎癥細胞因子的釋放和增加周圍挫傷部位存活神經元數量。結果顯示褪黑素的使用導致mTOR磷酸化，對神經炎癥產生抑制作用。與氧化應激反應的過程相同，炎癥反應也是TBI中不可避免的重要病理生理過程。已有證據顯示，抑制TBI后的炎癥反應，可以改善繼發性腦損傷。

　　3褪黑素在TBI中對皮質神經元再生的影響

　　研究表明TBI可以刺激內源性神經干細胞的增殖，但是激活的內源性神經干細胞在受損的皮質中不能轉化為成熟的神經元[30]。有研究發現褪黑素可促進急性腎損傷后的腎再生，并且提示褪黑素可以促進施萬細胞的增殖和遷移，從而促進周圍神經再生[31]。褪黑素在TBI中是否能促進神經元再生及神經元分化的相關研究目前比較少，Ge等[32]通過免疫熒光和末端脫氧核苷酸轉移酶dUTP末端標記法觀察新生神經元和凋亡細胞，結果顯示新生的未成熟神經元出現在損傷皮層，而新生的成熟神經元僅出現在TBI+褪黑素組。這表明TBI后損傷皮層形成新生神經元，而褪黑素促進了損傷皮層未成熟神經元向成熟神經元分化。證明褪黑素可促進TBI后損傷皮層神經元再生，改善認知功能恢復。褪黑素對受損皮層神經元分化的影響可能與調節細胞骨架組織的激素吲哚環的功能有關，細胞骨架組織可能與未成熟神經元的樹突成熟或與神經元遷移有關，以及與抗氧化和抗凋亡能力相關。褪黑素促進神經元再生在TBI中具有神經保護作用，可能會成為TBI治療前景和新關注點。但是，目前僅在動物模型實驗中觀察到此結果，相關文獻報道還較少，未來需要更多臨床研究來實踐。

　　4褪黑素在TBI患者中調節線粒體自噬的作用

　　線粒體是一種高度動態的超結構和產生能量的細胞器，與多種疾病相關，在一般情況下，神經元中線粒體的總數是通過分解和融合機制來維持動態平衡。Cui等[33]研究發現阻斷繼發性損傷的生化過程和細胞事件，如線粒體自噬，是改善神經損傷預后的關鍵。線粒體在TBI中具有興奮性毒性，最近的研究發現線粒體紊亂可導致繼發性神經元損傷和腦創傷死亡[34]。Salman等[35]研究發現，褪黑素治療可顯著減少線粒體分裂，促進線粒體融合和促進線粒體膜電位的恢復和氧化磷酸化，減少了細胞色素c的釋放；研究還發現褪黑素治療顯著抑制TBI大鼠凋亡相關因子樣蛋白（Bcl-2-Like Protein，Bax）和線粒體動力相關蛋白（dynamin-related protein 1，DRP1）向線粒體的易位，并且線粒體超微結構分析顯示了線粒體融合機制的激活，可能是褪黑素通過上調過氧化物酶體增殖活化受體γ輔助活化因子1α蛋白（α subunit of peroxisome proliferators-activated receptor-γcoactivator- 1，PGC-1α）促進線粒體融合，支持褪黑素對TBI大鼠的治療作用。結果顯示褪黑素在改善TBI大鼠的線粒體功能障礙方面的補救作用，并為線粒體介導的神經保護提供了支持，成為TBI后一種可能的治療方法。DRP1是促進線粒體融合的重要蛋白，褪黑素可以抑制DRP1介導的線粒體分裂，從而對TBI產生治療作用。

　　Lin等[36]研究表明，抑制有絲分裂，選擇性降解受損的線粒體自噬，可明顯增強炎癥誘導的TBI，給予褪黑素治療后通過mTOR途徑激活有絲分裂，減輕TBI誘導的炎癥。研究結果顯示褪黑素治療可通過增強線粒體自噬清除受損線粒體，顯著改善TBI后神經元死亡和行為缺陷，而自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）則通過抑制有絲分裂來逆轉這一效應，進一步說明自噬在TBI中的保護作用。Ding等[36]采用免疫熒光法測定自噬標記，即Beclin-1和微管相關蛋白1輕鏈3-II（microtubule associated protein 1 light chain 3-II，LC3-II），結果顯示3-MA對線粒體自噬有抑制作用，而褪黑激素增強了TBI后線粒體的自噬能力，并伴隨Bax到線粒體的轉移減少和細胞色素C釋放到細胞質減少。以上證明褪黑激素的治療可以增強小鼠TBI后的自噬能力，抑制線粒體凋亡途徑，從而保護小鼠在TBI后免受繼發性腦損傷。因此，褪黑素促進線粒體自噬可能是通過mTOR途徑激活，促進線粒體融合，抑制有絲分裂，負調控TBI中的炎癥因子分泌，從而產生TBI的保護作用。

　　綜上所述，褪黑素在TBI的治療作用一方面是抑制氧化應激、炎癥反應、細胞凋亡及線粒體自噬等細胞反應，減少創傷后神經系統損傷；另一方面，促進神經元的再生以及受損神經元的修復，促進神經功能修復。TBI的繼發性損傷是多種因素共同導致的復雜級聯反應，聯合治療可能是一種有效治療手段和方向。深入研究褪黑素在TBI中的治療作用機制及通過聯合治療手段來阻斷TBI后繼發性損傷的發生、發展等方面將為臨床治療提供新思路和策略。

　　[編輯] 郭 欣

　　參考文獻

　　[1] Shah EJ, Gurdziel K, Ruden DM. Mammalian models of traumatic brain injury and a place for in TBI research[J]. Front Neurosci, 2019, 13: 409.

　　[2] Cederberg D, Hansson HA, Visse E, et al. Antisecretory factor may reduce ICP in severe TBI-a case series[J]. Front Neurol, 2020, 11: 95.

　　[3] Luo C, Yang Q, Liu Y, et al. The multiple protective roles and molecular mechanisms of melatonin and its precursor N-acetyl serotonin in targeting brain injury and liver damage and in maintaining bone health[J]. Free Radic Biol Med, 2019, 130: 215-233.

　　[4] Emet M, Ozcan H, Ozel L, et al. A review of melatonin, Its receptors and drugs[J]. Eurasian J Med, 2016, 48(2): 135-141.

　　[5] Liu J, Clough SJ, Hutchinson AJ, et al. MT1 and MT2 melatonin receptors: a therapeutic perspective[J]. Annu Rev Pharmacol Toxicol, 2016, 56: 361-383.

　　[6] Barlow KM, Esser MJ, Veidt M, et al. Melatonin as a treatment after traumatic brain injury: a systematic review and meta-analysis of the pre-clinical and clinical literature[J]. J Neurotrauma, 2019, 36(4): 523-537.

　　[7] Campolo M, Ahmad A, Crupi R, et al. Combination therapy with melatonin and dexamethasone in a mouse model of traumatic brain injury[J]. J Endocrinol, 2013, 217(3): 291-301.

　　[8] Kelso ML, Scheff NN, Scheff SW, et al. Melatonin and minocycline for combinatorial therapy to improve functional and histopathological deficits following traumatic brain injury[J]. Neurosci Lett, 2011, 488(1): 60-64.

　　[9] Rui T, Wang H, Li Q, et al. Deletion of ferritin H in neurons counteracts the protective effect of melatonin against traumatic brain injury-induced ferroptosis[J]. J Pineal Res, 2021, 70(2): e12704.

　　[10] 賀莎莎,劉進友,李書劍,等. 抑制鐵死亡改善血管性癡呆大鼠認知功能的作用與機制研究[J]. 中國實用神經疾病雜志, 2021, 24(15):1289-1298.

　　[11] Kelley N, Jeltema D, Duan Y, et al. The NLRP3 inflammasome: an overview of mechanisms of activation and regulation[J]. Int J Mol Sci, 2019, 20(13): 3328.

　　[12] Yürüker V, Naz?ro?lu M, ?enol N. Reduction in traumatic brain injury-induced oxidative stress, apoptosis, and calcium entry in rat hippocampus by melatonin: possible involvement of TRPM2 channels[J]. Metab Brain Dis, 2015, 30(1): 223-231.

　　[13] Rish AD, Shen Z, Fu TM. It takes two to tango: two gates orchestrate the opening of human TRPM2[J]. Cell Calcium, 2022, 101: 102523.

　　[14] Senol N, Naz?ro?lu M, Yürüker V. N-acetylcysteine and selenium modulate oxidative stress, antioxidant vitamin and cytokine values in traumatic brain injury-induced rats[J]. Neurochem Res, 2014, 39(4): 685-692.

　　[15] Blázovics A. Food and food supplement antioxidants: targets in human antioxidant system and effects on the production of endogenous antioxidants[J]. Antioxidants Effects in Health, 2022:837-850.

　　[16] Cheng T, Wang W, Li Q, et al. Cerebroprotection of flavanol (-)-epicatechin after traumatic brain injury via Nrf2-dependent and -independent pathways[J]. Free Radic Biol Med, 2016, 92: 15-28.

　　[17] Wang J, Jiang C, Zhang K, et al. Melatonin receptor activation provides cerebral protection after traumatic brain injury by mitigating oxidative stress and inflammation via the Nrf2 signaling pathway [J]. Free Radic Biol Med, 2019, 131: 345-355.

　　[18] Dehghan F, Khaksari Hadad M, Asadikram G, et al. Effect of melatonin on intracranial pressure and brain edema following traumatic brain injury: role of oxidative stresses[J]. Arch Med Res, 2013, 44(4): 251-258.

　　[19] Fernández-Gajardo R, Matamala JM, Carrasco R, et al. Novel therapeutic strategies for traumatic brain injury: acute antioxidant reinforcement[J]. CNS Drugs, 2014, 28(3): 229-248.

　　[20] Bao Z, Fan L, Zhao L, et al. Silencing of A20 aggravates neuronal death and inflammation after traumatic brain injury:a potential trigger of necroptosis[J]. Front Mol Neurosci, 2019, 12: 222.

　　[21] Martens S, Jeong M, Tonnus W, et al. Sorafenib tosylate inhibits directly necrosome complex formation and protects in mouse models of inflammation and tissue injury[J]. Cell Death Dis, 2017, 8(6):e2904.

　　[22] Lalani AI, Zhu S, Gokhale S, et al. TRAF molecules in inflammation and inflammatory diseases[J]. Curr Pharmacol Rep, 2018, 4(1): 64-90.

　　[23] Zheng CF, Shi JR, Huang Y, et al. A20 inhibits lipopolysaccharide-induced inflammation in enterocytes [J]. World J Gastrointest Pharmacol Ther, 2016, 7(4): 540-549.

　　[24] Onizawa M, Oshima S, Schulze-Topphoff U, et al. The ubiquitin-modifying enzyme A20 restricts ubiquitination of the kinase RIPK3 and protects cells from necroptosis[J]. Nat Immunol, 2015, 16(7): 618-627.

　　[25] Liou CJ, Lee YK, Ting NC, et al. Protective effects of licochalcone a ameliorates obesity and non-alcoholic fatty liver disease via promotion of the Sirt-1/AMPK pathway in mice fed a high-fat diet[J]. Cells, 2019, 8(5): 447.

　　[26] Park JS, Leem YH, Park JE, et al. Neuroprotective effect of β-lapachone in MPTP-induced parkinson's disease mouse model: involvement of astroglial p-AMPK/Nrf2/HO-1 signaling pathways[J]. Biomol Ther (Seoul), 2019, 27(2): 178-184.

　　[27] Li C, Chen T, Zhou H, et al. BHDPC is a novel neuroprotectant that provides anti-neuroinflammatory and neuroprotective effects by inactivating NF-κB and activating PKA/CREB[J]. Front Pharmacol, 2018, 9: 614.

　　[28] Rehman SU, Ikram M, Ullah N, et al. Neurological enhancement effects of melatonin against brain injury-induced oxidative stress, neuroinflammation, and neurodegeneration via AMPK/CREB signaling [J]. Cells, 2019, 8(7): 760.

　　[29] Ding K,Xu JG,Wang HD, et al. Melatonin protects the brain from apoptosis by enhancement of autophagy after traumatic brain injury in mice[J]. Neurochem Int, 2015, 91: 46-54.

　　[30] He N, Mao XJ, Ding YM, et al. New insights into the biological roles of immune cells in neural stem cells in post-traumatic injury of the central nervous system[J]. Neural Regeneration Research, 2023, 18(09):1908-1916.

　　[31] Pan B, Jing L, Cao M, et al. Melatonin promotes schwann cell proliferation and migration via the shh signalling pathway after peripheral nerve injury[J]. Eur J Neurosci, 2021, 53(3): 720-731.

　　[32] Ge J, Chen D, Ben J, et al. Effect of melatonin on regeneration of cortical neurons in rats with traumatic brain injury[J]. Clin Invest Med, 2020, 43(4): e8-16.

　　[33] Cui C, Cui J, Jin F, et al. Induction of the vitamin D receptor attenuates autophagy dysfunction- mediated cell death following traumatic brain injury[J]. Cell Physiol Biochem, 2017, 42(5): 1888-1896.

　　[34] Dobrachinski F, da Rosa Gerbatin R, Sartori G, et al. Regulation of mitochondrial function and glutamatergic system are the target of guanosine effect in traumatic brain injury[J]. J Neurotrauma, 2017, 34(7): 1318-1328.

　　[35] Salman M, Kaushik P, Tabassum H, et al. Melatonin provides neuroprotection following traumatic brain injury-promoted mitochondrial perturbation in wistar rat[J]. Cell Mol Neurobiol, 2021, 41(4): 765-781.

　　[36] Lin C, Chao H, Li Z, et al. Melatonin attenuates traumatic brain injury-induced inflammation: a possible role for mitophagy[J]. J Pineal Res, 2016, 61(2): 177-186.